时间：2023-02-03 10:14:24 访问次数:
化疗相关的认知功能障碍（chemotherapy-related cognitive impairment，CRCI）是一种化疗给药后诱发的认知功能损伤，其常见的临床表现为注意力、记忆、多任务处理能力、决策能力缺失、学习和语言能力缺陷 [1,2]。已有研究报道，使用全身性化疗给药的病人中超过60%出现了化疗相关的认知功能障碍，并且终止化疗后仍有可能会持续数年[3]。现有的机制多围绕于药物对神经细胞的直接毒性作用，包括血脑屏障（BBB）破坏，海马脑区神经元缺失，白质损伤，神经元炎症损伤，氧化应激等，然而其确切的潜在的机制尚未被完全阐明[4]。因此，解析CRCI发生发展的新机制将有助于药物研发和临床治疗方案的优化，进而缓解化疗给患者带来的极大痛苦。
神经血管单元（neurovascular unit，NVU）是指将脑血管（内皮细胞，周细胞）和神经细胞（胶质细胞，神经元）看作一个整体来研究，自提出以来为多种神经系统疾病发病机制研究和药物靶点筛选提供了新的机遇 [5]。化疗药物硼替佐米据报道并不能透过BBB，但是却有临床案例及影像学结果表明硼替佐米使用后可诱发包括认知损伤在内的中枢不良反应[6-8]。那么硼替佐米是否通过诱发血管源性损伤间接导致化疗相关的认知功能障碍，其分子及细胞机制又是怎样的？有待进一步深入探索。
2023年1 月1日，南京医科大学基础医学院卢应梅教授课题组和药学院韩峰教授课题组合作在Autophagy上发表了题为“Endothelial TFEB signaling-mediated autophagic disturbance initiates microglial activation and cognitive dysfunction”的研究。卢应梅教授和韩峰教授为论文共同通讯作者，博士研究生卢亚萍为文章的第一作者，该研究报道了化疗药物硼替佐米诱发认知功能障碍同脑血管内皮细胞自噬紊乱之间的关系，并揭示了脑血管内皮TFEB-STAT3-IL23A信号异常在小胶质细胞激活和认知功能障碍疾病进程中发挥了关键性作用。（拓展阅读：卢应梅/韩峰团队相关研究进展，详见“逻辑神经科学”报道（点击阅读）：STTT︱卢应梅/韩峰团队合作揭示小脑IV/V叶到顶核的环路异常导致共济失调发生分子机制）
本文中，研究者发现小鼠注射化疗药物硼替佐米（1 mg/kg）后，出现认知相关行为学异常（图1A-C）。同时伴随着海马脑区兴奋性和抑制性突触数量减少（图1D-F），而对海马和前额叶皮层小胶质细胞进行数量和形态学分析，表明小胶质细胞过度激活（图1G-M），且具有增强的突触吞噬活性（图2F-I）。以上结果提示硼提佐米处理引发小胶质细胞激活，突触及认知功能的缺失。
图1 硼替佐米处理介导小胶质细胞激活，突触及认知功能缺失
（图源：Lu YP, et al., Autophagy, 2023）
在这里研究者使用CSF1R抑制剂PLX5622清除脑内的小胶质细胞，发现清除掉过度激活的小胶质细胞逆转了硼替佐米介导的突触及认知缺失（图2）。得出结论硼替佐米诱导的小胶质细胞激活是突触及认知功能缺失的关键因素。
图2 小胶质细胞清除恢复了硼替佐米诱发的突触及认知缺失
（图源：Lu YP, et al., Autophagy, 2023）
脑血管内皮细胞损伤与多种神经系统疾病相关联[9,10]。RNA-seq结果表明，硼替佐米处理导致脑血管内皮细胞自噬-溶酶体通路异常（图3A, B）。研究者使用双标LC3腺病毒标示自噬流的变化，结果表明了硼替佐米处理抑制了脑血管内皮细胞的自噬流（图3C-E）；并且硼替佐米处理使自噬受体分子SQSTM1在脑血管内皮细胞中过度堆积（图3F-I）。证明硼替佐米介导内皮源性自噬紊乱，包括自噬流抑制和自噬底物的堆积，提示以上现象可能是由于溶酶体的功能损伤引起的。
图3 硼替佐米处理介导脑血管内皮细胞自噬紊乱
（图源：Lu YP, et al., Autophagy, 2023）
转录因子EB（TFEB），在生物体内调控溶酶体生物合成及自噬相关基因的表达[11,12]。研究者发现硼替佐米处理减少了TFEB核转移，并使其下游溶酶体膜相关蛋白LAMP1和LAMP2A表达下调；使LGALS3标记的损伤溶酶体数量增加，而LAMP1阳性的健康溶酶体数量减少（图4）。以上结果表明硼替佐米处理使溶酶体更新障碍，损伤的溶酶体在细胞内过度堆积，提示内皮源性TFEB表达异常介导的溶酶体功能障碍是导致脑血管内皮自噬紊乱的根本原因。
图4 硼替佐米损伤脑血管内皮细胞TFEB核转移促进溶酶体功能缺失
（图源：Lu YP, et al., Autophagy, 2023）
已有研究表明Ca2+内流增加可激活钙调磷酸酶PPP3进而介导TFEB的核转移，促进溶酶体功能增强[13]。研究者对脑血管内皮进行全细胞膜片钳记录，发现强心苷类药物地高辛（digoxin）可恢复硼替佐米介导的Ca2+内流减少（图5A-E）；逆转硼替佐米引起的钙调磷酸PPP3失活（图5F-H）。以上结果提示地高辛通过增加脑血管内皮细胞Ca2+电流来增强PPP3活性，参与调控TFEB介导的自噬溶酶体通路。
图5 地高辛诱导胞内Ca2+电流增加恢复硼替佐米介导的PPP3失活
（图源：Lu YP, et al., Autophagy, 2023）
研究者对RNA-seq结果进行分析，发现硼替佐米处理激活脑血管内皮细胞炎症信号通路，使IL23A的表达显著上调，并且增加了血清和脑血管内皮细胞培养上清中IL23A的含量（图6A-D）。体外和体内实验表明，联合地高辛处理显著抑制了硼替佐米介导的脑血管内皮IL23A表达增加，恢复了硼替佐米介导的小胶质细胞激活和认知功能障碍（图6 E-M）。高尔基染色的结果也显示地高辛处理有效地恢复了硼替佐米介导的spine数量减少（图6 N-R）。由此，以上结果表明了地高辛抑制IL23A的表达分泌，在体逆转硼替佐米引起的小胶质细胞激活，减轻突触及认知功能的缺失。
图6 地高辛抑制脑血管内皮细胞IL23A表达并恢复硼替佐米介导的认知功能缺失
（图源：Lu YP, et al., Autophagy, 2023）
为了进一步阐明脑血管内皮IL23A表达上调同TFEB介导的自噬异常之间的关系，研究者通过JASPAR数据库筛选和双荧光素酶报告基因分析实验，证实了IL23A启动子区域存在STAT3的结合位点并可促进IL23A转录。免疫印迹实验表明硼替佐米增加了STAT3的转录激活形式p-STAT3（Y705、S727）的表达，而联合地高辛处理使其上调得到抑制。为了进一步阐明TFEB同STAT3之间的关系，研究者通过CRISPR-Cas9技术对HEK293细胞中TFEB进行敲除，发现TFEB敲除增加了p-STAT3（Y705、S727）的表达，而恢复TFEB表达使p-STAT3上调得到抑制。以上结果证明了TFEB负向调控STAT3的转录活性，促进了IL23A表达。
图7 TFEB负向调控STAT3的转录活性促进IL23A表达
（图源：Lu YP, et al., Autophagy, 2023）